Las enfermedades infecciosas se presentan al contacto con patógenos. A pesar de muchos esfuerzos para mitigarlas, dichas enfermedades son aún una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Mycobacterium tuberculosis, Dengue, Zika y Chikungunya son enfermedades de gran impacto en salud pública. El diagnóstico oportuno de estas enfermedades es esencial. Es por eso que, en los últimos años, diversos métodos que buscan mejorar el diagnóstico han sido introducidos en el mercado global. A pesar de ello, en la actualidad, todavía no se cuenta con una metodología apropiada y realista, que sea específica, sensible, económica y práctica. En ese sentido, el objetivo del presente estudio es diseñar, desarrollar y validar una prueba en punto de atención para el diagnóstico simultáneo de Mycobacterium tuberculosis y detección de resistencia a Rifampicina e Izoniacida (TB-MDR), y el diagnóstico simultáneo de Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3, Dengue 4, Zika y Chikungunya. Para lograrlo, se analizarán varios genomas de los patógenos mencionados y se diseñarán primers (iniciadores de la reacción isotérmica) LAMP específicos. Además, se desarrollará el método de pretratamiento de muestra biológica que permitirá una buena reacción isotérmica. Luego, se desarrollará y optimizará la fórmula de ensayo de amplificación isotérmica en formato líquido y se procederá con la migración hacia el formato liofilizado, una vez probado. Los kits desarrollados entrarán a un proceso de validación en laboratorio (Lima) y, luego, en campo (Ica y San Martín) para evaluar y demostrar su rendimiento. Los resultados de la validación serán comparados y analizados estadísticamente. Finalmente, se presentará el prototipo de los kits desarrollados y el plan tecnológico de negocios. Con el presente proyecto, se espera que el Perú se posicione a la vanguardia del mundo en el desarrollo e implementación de sistemas de diagnóstico oportuno.  https://t.ly/tfhU

Las enfermedades infecciosas son las manifestaciones clínicas originadas por el contacto con un microorganismo patógeno. A pesar de muchos esfuerzos para mitigarlas, dichas enfermedades son aún una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Muchos factores están involucrados en la emergencia y dispersión. Las enfermedades infecciosas son prevalentes en regiones tropicales y subtropicales del mundo, siendo el Perú una de las regiones más afectadas. Adicionalmente al clima, la geografía accidentada que posee, el crecimiento desproporcionado de la población, los cambios de comportamiento y la falta de un sistema de advertencia y respuesta temprana de acuerdo a la realidad del país, exacerban los efectos de las enfermedades infecciosas.

La tuberculosis (TB) es una enfermedad bacteriana altamente infectocontagiosa, generalmente subdiagnosticada. Adicionalmente, la tuberculosis multidrogorresistente (TB-MDR), aquella TB resistente al menos a Isoniacida y Rifampicina, sigue siendo un gran problema de salud pública a nivel mundial. En el Perú, Mycobacterium tuberculosis es una de las infecciones más prevalentes e importantes, con gran impacto socioeconómico. El diagnóstico de TB, en la mayoría de laboratorios a nivel nacional, se realiza por la técnica convencional de baciloscopia (BK). Sin embargo, esta técnica presenta varias limitaciones, ya que demuestra muy baja sensibilidad, no diferencia el M. tuberculosis de otras micobacterias no tuberculosas y no permite detectar la resistencia a los fármacos. Existen laboratorios en la red de Lima (ninguno en las regiones) que cuentan con otro sistema de detección, llamado Xpert MTB/RIF. No obstante, esta prueba solo diagnóstica TB y detecta la resistencia a Rifampicina, obviando a la Izoniacida, además de representar un enorme costo.

El Dengue, Zika y Chikungunya representan las infecciones arbovirales más importantes en el Perú. La zona costera y oriental del país son las más afectadas, con gran frecuencia de casos durante todo el año. El diagnóstico de estos virus, en la mayoría de los laboratorios a nivel nacional, se realiza por técnicas convencionales de ELISA de captura. Sin embargo, se ha reportado baja sensibilidad y especificidad en los ensayos, reacción cruzada entre arbovirus de la misma familia, así como tiempos prolongados de operación. Existen tres Laboratorios de Referencia Regional que cuentan con la metodología de PCR en tiempo real para la detección de Dengue, Zika y Chikungunya. No obstante, esta prueba significa un alto costo de acondicionamiento y mantenimiento de laboratorio y equipos, insumos y personal capacitado.

En la actualidad, el total de muestras positivas y el 10% de muestras negativas procesadas a nivel nacional por las técnicas convencionales arriba descritas son remitidas al INS (Lima) para su confirmación y caracterización molecular por el método de sonda en línea (TB) y PCR en tiempo real (Dengue, Zika, Chikungunya), deformando el sentido de diagnóstico oportuno al paciente. Las metodologías moleculares con las que cuenta el INS son específicas y sensibles, pero requieren un laboratorio con equipamiento sofisticado y personal entrenado. La transferencia tecnológica de estas metodologías a todos los Laboratorios de Referencia Regional es una meta inaccesible. La transferencia tecnológica de estas metodologías a establecimientos de salud de primer nivel es una tarea irreal.

En los últimos años, diversas metodologías moleculares han sido introducidas al mercado global con el objetivo de simplificar el diagnóstico. A pesar de ello, en la actualidad, no se cuenta con una metodología apropiada para el diagnóstico oportuno de Mycobacterium tuberculosis, detección de resistencia a Rifampicina e Izoniacida (TB-MDR), y diagnóstico de Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3, Dengue 4, Zika y Chikungunya. En ese sentido, resulta necesario encontrar una alternativa molecular para el diagnóstico en el punto de atención que sea específica, sensible, económica y práctica.

Muchos investigadores y empresas han dedicado tiempo al desarrollo de pruebas en punto de atención (POCT) molecular, utilizando una variedad de métodos para resolver los problemas mencionados anteriormente. Algunos de los problemas ya se resolvieron con el avance de las tecnologías, incluido el ensayo de amplificación de ácido nucleico isotérmico. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la herramienta de ensayo de diagnóstico molecular más popular, también alcanzó un gran logro al proporcionar máquinas de PCR más simples y pequeñas y métodos de amplificación de ácidos nucleicos convenientes y rápidos. Sin embargo, estos avances de la PCR no están lo suficientemente calificados para lograr un POCT molecular prácticamente compatible en comparación con los kits de POCT rápidos basados en inmunoensayos. Por lo tanto, es necesario avanzar más en muchos aspectos para lograr un POCT molecular de calidad.

Después de comparar diversos ensayos de amplificación de ácido nucleico isotérmico, se selecciona el ensayo de amplificación de ácido nucleico mediado por lazo (LAMP) como la herramienta más prometedora adecuada para POCT molecular. No obstante, el ensayo mediado por lazo todavía tiene muchos valores predeterminados para ser usados a nivel práctico y, por lo tanto, planeamos hacer un gran avance en el presente estudio.

Una de las partes más difíciles del LAMP es diseñar los conjuntos de primers optimizados. Dado que el LAMP utiliza 4 o 6 primers que trabajan simultáneamente de manera coordinada. La complejidad del diseño de los primers LAMP se torna luego en una gran ventaja al fortalecer la especificidad del ensayo. Cabe también resaltar que los primers LAMP permiten la formación de una estructura de mancuerna, lo que hace compacto el producto de amplificación y, de esa forma, eleva la sensibilidad del ensayo.

La practicidad en el trasporte, almacenamiento y operación es también un factor importante a tomar en cuenta en los POCT. El propósito del presente estudio es desarrollar una prueba que pueda ser usada del nivel más complejo hasta el nivel más sencillo. Por lo tanto, la versión final del kit diagnóstico será un kit completamente liofilizado que pueda mantenerse a temperatura ambiente, incluso en zonas tropicales y subtropicales, como la selva peruana, sin ningún problema. Este kit contendrá todos los insumos necesarios para la reacción, para lo cual necesita únicamente la adición de agua y la muestra pretratada. La lectura de los resultados se dará de manera visual luego de un máximo de 30 minutos por el cambio de color en la solución.

Resulta importante señalar que las pruebas moleculares requieren de material genético para funcionar. La mayoría de ellas utilizan un paso previo de extracción ADN/ARN con un kit de purificación de ácidos nucleicos, lo cual necesita equipos y ambientes idóneos para su ejecución. En el presente estudio, se desarrollará un método de pretratamiento de muestra biológica simple y efectivo, compatible con la fórmula del kit diagnóstico, que sólo es posible por tratarse de LAMP.

Simplificar las metodologías no solo genera mejoras en los procesos operativos, sino también reduce los costos de manufactura. Por consiguiente, el kit diagnóstico que se porpone será muy económico en comparación con aquellos POCT comercialmente disponibles en la actualidad.

Las razones descritas anteriormente permitirán instaurar una plataforma de desarrollo tecnológico para mejorar el sistema de diagnóstico nacional y mundial. Asimismo, se iniciará esta plataforma con el proyecto de desarrollo de un kit diagnóstico (3 tubos) de Mycobacterium tuberculosis y detección de resistencia a Rifampicina e Izoniacida y un kit diagnóstico (6 tubos) de Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3, Dengue 4, Zika y Chikungunya, ya que son enfermedades infecciosas de gran repercusión en salud pública del Perú. El desarrollo e implementación de estos kits diagnósticos tendrá un impacto no solo en el sector salud, sino también en el sector económico, producción y trabajo.

Modalidad de proyecto: Proyecto de investigación multidisciplinario

Son propuestas de investigación aplicada o desarrollo tecnológico con objetivos y actividades multidisciplinarias. Participan, por lo menos, dos grupos de investigación de diversas disciplinas, ya sea de la misma o de diferente entidad.

Los proyectos deben ser presentados de manera asociativa (con una o más entidades asociadas).

La conformación mínima es la siguiente:

• Un investigador principal
• Dos coinvestigadores (uno por cada grupo de investigación)
• Dos tesistas de posgrado
• Un gestor tecnológico
• Un coordinador administrativo

Nota: se debe contar con la participación de, por lo menos, un investigador de una institución proveniente de alguna región del interior del país.

Tipo de proyecto: Desarrollo tecnológico

Subsector: Salud

Sector: General

Lugar de ejecución del proyecto: Lima – Ica – San Martín

Fecha de inicio: 01/12/2018

Fecha de cierre: 01/12/2021

Plazo de ejecución (meses): 36

Objetivo principal

Establecer una plataforma de colaboración interdisciplinaria nacional e internacional para el desarrollo tecnológico que ayude a solucionar los problemas en el sector salud del Perú y el mundo. Ello involucra a jóvenes científicos y promueve la generación de conocimientos, así como impulsa la materialización de los resultados y promociona los productos finales de la investigación. El presente estudio tiene el propósito de ser el cimiento del desarrollo tecnológico de pruebas de diagnóstico molecular rápido en puntos de atención de enfermedades infecciosas, que coloquen al Perú a la vanguardia del mundo en el desarrollo e implementación de sistemas de diagnóstico oportuno.

Objetivo específico 1

Determinar la estructura genómica de Mycobacterium tuberculosis, Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3, Dengue 4, Zika y Chikungunya de las cepas peruanas. Realizar un análisis exploratorio para definir los genes objetivos y diseñar los primers LAMP específicos.

Objetivo específico 2

Desarrollar y optimizar el método de extracción de ADN de TB (pretratamiento de la muestra de esputo) y el método de extracción de ARN de Dengue, Zika y Chikungunya (pretratamiento de la muestra de sangre).

Objetivo específico 3

Desarrollar y optimizar la fórmula de ensayo de amplificación isotérmica para el diagnóstico de M. tuberculosis y la detección de TB-MDR y la fórmula de ensayo de amplificación isotérmica para el diagnóstico de Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3, Dengue 4, Zika y Chikungunya.

Objetivo específico 4

Validar las metodologías de extracción y de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos en laboratorio, utilizando muestras previamente caracterizadas por métodos estándar de oro. Asimismo, validar las metodologías de pretratamiento de muestra y de amplificación isotérmica en condiciones de campo, empleando muestras biológicas de pacientes con la sintomatología pertinente en regiones del interior del Perú.

Institución responsable del proyecto

Instituto Nacional de Salud (INS)

RUC: 20131263130

Tipo de entidad: Institutos o centros de investigación de régimen público, exceptuando al ITP y sus CITE

Régimen: Público

Tipo de organización: Sin fines de lucro

Departamento: Lima

Provincia: Lima

Distrito: Chorrillos

Dependencias: Centro Nacional de Salud Pública

Instituciones asociadas

Universidad Nacional de Kyungpook

Tipo de entidad: Universidades extranjeras

Régimen: Público

País: Corea del Sur

Ciudad: Daegu

Mmonitor, Inc.

Tipo de entidad: Empresas

Régimen: Privado

País: Corea del Sur

Ciudad: Daegu

Dirección Regional de Salud de Ica

RUC: 20171178585

Tipo de entidad: Institutos o centros de investigación de régimen público

Régimen: Público

País: Perú

Departamento: Ica

Provincia: Ica

Distrito: Ica

Laboratorio de Referencia Regional de Salud Pública San Martín

RUC: 20494013453

Tipo de entidad: Institutos o centros de investigación de régimen público

Régimen: Público

País: Perú

Departamento: San Martín

Provincia: San Martín

Distrito: Tarapoto

Investigador principal

Nombres: Oscar Roberto

Apellido paterno: Escalante

Apellido materno: Maldonado

Grado académico: Doctorado

Nombre del grado académico: Doctor en Ciencias Médicas

Entidad: Instituto Nacional de Salud (INS)

Dependencia: Centro Nacional de Salud Pública

Coinvestigador

Nombres: Hyung Soo

Apellido paterno: Han

Grado académico: Doctorado

Entidad: Universidad Nacional de Kyungpook

Dependencia: Departamento de Fisiología, Escuela de Medicina

Coinvestigador

Nombres: Kwang Hee

Apellido paterno: Lee

Grado académico: Doctorado

Entidad: Mmonitor, Inc.

Dependencia: Dirección Ejecutiva de Desarrollo de Negocios y Desarrollo de Nuevas Tecnologías

Coinvestigador

Nombres: Nancy María

Apellido paterno: Brizuela

Apellido materno: Pow Sang

Grado académico: Magíster

Entidad: Dirección Regional de Salud de Ica

Dependencia: Laboratorio de Referencia Regional en Salud Pública Ica

Coinvestigador

Nombres: Heriberto

Apellido paterno: Arevalo

Apellido materno: Ramirez

Grado académico: Magíster

Entidad: Laboratorio de Referencia Regional de Salud Pública San Martín

Dependencia: LRR San Martin

Tesista

Nombres: Alexandra Nicole

Apellido paterno: Sheen

Apellido materno: Sánchez

Tipo de tesis: Licenciatura

Entidad: Instituto Nacional de Salud (INS)

Tesista

Nombres: Efraín Enrique

Apellido paterno: Cabrera

Apellido materno: Rojas

Tipo de tesis: Maestría

Entidad: Instituto Nacional de Salud (INS)

Tesista

Nombres: María Paquita

Apellido paterno: García

Apellido materno: Mendoza

Tipo de tesis: Maestría

Entidad: Instituto Nacional de Salud (INS)

Gestor tecnológico

Nombres: Gestor tecnológico no identificado

Apellido paterno: Gestor tecnológico no identificado

Apellido materno: Gestor tecnológico no identificado

Entidad: Instituto Nacional de Salud (INS)

Coordinador administrativo

Nombres: Moisés David

Apellidos: Loayza Luperdi

Entidad: Instituto Nacional de Salud (INS)

Rubros financiables

1. Recursos humanos (hasta 50% del monto financiado)

1. Incentivo monetario para el investigador principal y coinvestigadores: no debe sobrepasar el máximo de S/ 2,000 mensuales por investigador.
2. Pago a los tesistas: no debe sobrepasar el máximo de S/ 1,500 mensuales por tesista.
3. Pago al personal técnico o asistente de investigación: no debe sobrepasar el máximo de S/ 1,000 mensuales por técnico.
4. Honorarios o incentivos para un gestor tecnológico: no debe de sobrepasar el máximo de S/. 1,500 mensuales.

2. Equipos y bienes duraderos (hasta 20% del monto financiado)

Corresponde a la adquisición de equipos menores para el proyecto de investigación.

3. Materiales e insumos

1. Materiales, insumos, reactivos, accesorios, componentes electrónicos o mecánicos, bienes no inventariables.
2. Material bibliográfico, tales como manuales, bases de datos, libros especializados, otros, y/o suscripciones a redes de información (en físico o electrónico).
3. Software especializado para el desarrollo de los proyectos de investigación.

4. Viajes

Corresponde a los gastos de viajes relacionados a actividades propias del proyecto de investigación.

Los gastos que aplican para este rubro son los siguientes:

1. Pasajes: terrestres, aéreos, nacionales e internacionales, en clase económica.
2. Viáticos: comprenden los gastos por concepto de alimentación, hospedaje y movilidad (hacia y desde el lugar de embarque), así como el desplazamiento en el lugar donde se realizan las actividades. El concepto de viáticos es aplicable para estancias cuya duración sea menor a los quince (15) días calendario, considerando los topes máximos diarios detallados en el Anexo 2.
3. Manutención: comprenden los gastos de alojamiento, alimentación y movilidad local durante su permanencia en el lugar sede del objeto del beneficio otorgado, o desplazamientos relacionados con el mismo. El concepto de manutención es aplicable siempre que se trate de una estancia cuya duración sea mayor o igual a quince (15) días calendario, considerando los topes máximos diarios detallados en la convocatoria.
4. Seguro de viaje: el seguro es de carácter obligatorio y su valor debe estar de acuerdo al precio de mercado. La cobertura típicamente incluye gastos médicos de emergencia, muerte accidental, invalidez e imprevistos logísticos durante el viaje (retraso de vuelos, demora o pérdida de equipaje, robos, etc.). El precio del seguro puede variar en función a la edad, duración del viaje y el destino. Se puede financiar hasta un máximo de S/ 2,000.

5. Servicios de no consultoría.

Corresponde a los gastos de contratación de personas naturales o jurídicas para la ejecución de actividades de índole técnica especializada, consideradas como críticas para lograr el buen resultado del proyecto de investigación: servicios de laboratorio, colección de datos, procesamiento de muestras, análisis y diseño.

6. Otros servicios

Corresponde a los gastos de contratación de personas naturales o jurídicas para la ejecución de actividades complementarias del proyecto de investigación, tales como:

a.Actividades de difusión:

1. Gastos de organización de taller de cierre del proyecto.
2. Costo de publicación de artículos en revistas indizadas.
3. Costo de inscripción para participar en eventos o para discutir los resultados con personal interesado o calificado.

b. Actividades complementarias de la investigación:

1. Gastos de importación y desaduanaje de materiales, insumos o equipos relacionados al proyecto de investigación que se adquieran en el extranjero.
2. Gastos relacionados a la obtención del título o grado.
3. Gastos relacionados a la solicitud de patentes.
4. Gastos de mantenimiento correctivo para los equipos adquiridos u otro equipo de laboratorio que deba usarse en el proyecto.

7. Gastos de gestión (hasta 10% del monto financiado)

Corresponde al incentivo monetario para el coordinador administrativo, útiles de oficina y servicios de imprenta.