La retinosis pigmentaria (RP) se refiere a un grupo de desórdenes hereditarios que se caracterizan por la pérdida de función de la retina, es la causa más común de ceguera en adultos y afecta, mayoritariamente, a pacientes varones. En este contexto, nuestro proyecto tiene como objetivo principal sentar las bases de una plataforma que permita la corrección de mutaciones genéticas en células retinales obtenidas a partir de tejido cultivado en laboratorio y proveniente del mismo paciente afectado por RP. En primera instancia, el proyecto establecerá protocolos para la obtención de líneas celulares pluripotenciales (iPSC) que puedan ser convertidas en cualquier tipo celular del cuerpo humano, incluyendo células retinales. Estas células iPSC serán obtenidas a partir de una biopsia de piel de pacientes afectados por RP o voluntarios sanos. Los pacientes afectados por RP que participarán en este estudio provienen de la comunidad de Parán (Huara, Lima), población que viene siendo estudiada por nuestro centro de investigación (CIGBM-USMP) y en la cual se identificó recientemente una mutación genética (deleción de 11pb) en el gen Retinitis Pigmentosa GTPase Regulator (RPGR), gen ligado a la RP. Las células iPSC portadoras de la mutación serán posteriormente sometidas a técnicas de modificación genética modernas (CRISPR/Cas9) para corregir el defecto genético en el laboratorio. Una vez obtenidas las células iPSC corregidas (sin el defecto genético), estas serán convertidas (diferenciadas) en células retinales normales, las que podrían ser trasplantadas en las retinas de pacientes afectados por RP. En consecuencia, el financiamiento de FONDECYT permitirá traducir años de investigación básica enfocada en la genética de desórdenes oftalmológicos que afectan a poblaciones peruanas, y que ha sido realizada en nuestro centro de investigación, en una plataforma preclínica para el desarrollo de terapia génica en nuestro país.  https://ibit.ly/OqfX

Actualmente, no existe un tratamiento efectivo para las retinopatías degenerativas hereditarias, como la retinosis pigmentaria (RP). Por este motivo, el trasplante de células derivadas de células madre en la retina es explorado como una terapia para este tipo de enfermedades. Ensayos clínicos recientes, en los que se evalúa el trasplante de células y tejidos alogénicos derivados de células madre embrionarias humanas (hESC por sus siglas en ingles) en la retina, han demostrado que el procedimiento es seguro y relativamente eficaz. Sin embargo, el uso de hESC es controversial debido a que las células trasplantadas provienen de embriones humanos y, por su carácter alogénico (tejido trasplantado de un paciente B a un paciente A), pueden causar reacciones inmunes en el hospedero o incluso su rechazo. Sin embargo, el uso de células derivadas de células madre del mismo hospedero (trasplante autólogo) puede evitar estos problemas.

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se presentan como una gran opción para resolver estos y otros problemas asociados con el trasplante de células madre. Usando protocolos establecidos, los fibroblastos de una biopsia de piel pueden ser desdiferenciados a un estado pluripotente y servir como una fuente renovable y autóloga de células que obvian las complicaciones técnicas y éticas del uso de hESC. En el caso de retinopatias hereditarias, como RP, la mutación original causante de la enfermedad aún estaría presente en las iPSC del paciente, por lo cual se necesitaría la corrección de dicha mutación usando técnicas de edición genética tales como CRISPR/Cas9. La técnica CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspersed short palindromic repeatsad/CRISPR associated 9) es una técnica de edición génica adaptada del sistema inmunitario bacteriano (8) con gran especificidad y fácilmente programable.

De esta forma, nuestro proyecto busca generar células iPSC de pacientes afectados con RP y portadores de la mutación de Parán. Esta es una deleción de 11pb en el gen regulador de la GTPasa de la retinitis pigmentosa (RPGR por sus siglas en ingles), cuyo modo de transmisión genética está ligada al sexo (X-linked). El presente proyecto establecerá las bases de una plataforma que permitirá editar y corregir con precisión la mutación de Parán en el gen RPGR y producir células iPSCs corregidas para su uso eventual en el trasplante autólogo.

Las distrofias hereditarias de la retina, entre ellas la retinitis pigmentosa (RP), son enfermedades clínica y genéticamente heterogéneas que afectan a las células de la retina y al epitelio pigmentario de la retina (RPE) con ceguera como resultado final. Millones de personas en el mundo padecen enfermedades degenerativas de la retina como la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), la retinosis pigmentaria (RP)  o la enfermedad de Stargardt (SD), las cuales son clínica y genéticamente heterogéneas y afectan a las células de la retina y al epitelio pigmentario de la retina (RPE) con ceguera como resultado final. Las cegueras son costosas y son una carga importante para nuestra sociedad. Sin embargo, actualmente, no existen tratamientos disponibles para estos trastornos; en consecuencia, es prioritario desarrollar tratamientos efectivos, así como métodos preventivos.

En el caso multifamiliar de Parán, es indispensable desarrollar terapias que ayuden a mitigar las consecuencias de la RP, dado que su prevalencia en esta población es de más del 20 % (datos no publicados) y afecta a individuos de 6 familias en hasta 4 generaciones identificadas. En este sentido, el uso de células madre pluripotenciales para la generación de tejidos y/o células retinales se presenta como una alternativa para restaurar la visión en pacientes afectados. Particularmente, el uso de líneas celulares iPSC para su trasplante autólogo es de gran interés debido a que presentan ventajas importantes con respecto a otros tipos de células madre pluripotenciales de origen humano. En el caso de la RP, ensayos clínicos en los que se utilizaron trasplantes alogénicos de tejido retinal, obtenidos a partir de cultivos de células madre embrionarias humanas (hESC), han mostrado que el procedimiento de trasplante es relativamente seguro y con un gran potencial terapéutico. Sin embargo, las terapias basadas en trasplantes de células derivadas de hESC requieren el uso de tejido embrionario humano alogénico, lo que representa un problema de tipo ético y un riesgo de rechazo inmunitario. El uso de células madre inducidas (iPSC), derivadas a partir de fibroblastos obtenidos del mismo paciente y para el trasplante en la retina, son una fuente renovable y autóloga de células de reemplazo que evitan las complicaciones éticas e inmunológicas de las hESC.

Sin embargo, la mutación original causante de la enfermedad aún estaría presente en las iPSC derivadas de fibroblastos del paciente, por lo cual es necesaria su corrección precisa a través de herramientas de edición génica como la tecnología CRISPR/Cas9. Las ventajas de la técnica CRISPR/Cas9 sobre otras herramientas de edición génica incluyen su facilidad de diseño y alta especificidad. Por ello, nuestra plataforma plantea la integración de ambas técnicas, obtención de células iPSC y edición génica usando CRISPR/Cas9, para implementar un pipeline molecular que permita la trasplantación de células retinales autólogas y genéticamente sanas en la retina de portadores de la mutación de Parán y afectados con RP. Con ello, el presente proyecto pretende sentar las bases de una plataforma de terapia génica que permita llevar a cabo tales procedimientos en nuestro medio. No obstante, el alcance del proyecto se limitará solo a la generación de células iPSC, edición génica y su diferenciación en tejidos y/o células retinales. El estudio funcional de estas células en modelos animales y su eventual uso en ensayos clínicos no forma parte de este proyecto y será llevado a cabo en el futuro en colaboración con laboratorios especializados.

Modalidad de proyecto: Proyecto de investigación multidisciplinario

Son propuestas de investigación aplicada o desarrollo tecnológico con objetivos y actividades multidisciplinarias. Participan, por lo menos, dos grupos de investigación de diversas disciplinas, ya sea de la misma o diferente entidad.

Los proyectos deben ser presentados de manera asociativa (con una o más entidades asociadas).

La conformación mínima es la siguiente:

• Un investigador principal
• Dos coinvestigadores (uno por cada grupo de investigación)
• Dos tesistas de posgrado
• Un gestor tecnológico
• Un coordinador administrativo

Nota: se debe contar con la participación de, por lo menos, un investigador de una institución proveniente de alguna región del interior del país.

Tipo de proyecto: Desarrollo tecnológico

Subsector: Salud

Sector: General

Lugar de ejecución del proyecto: Lima

Fecha de inicio:  03/12/2018

Fecha de cierre:  30/07/2021

Plazo de ejecución (meses): 31

Objetivo principal

El proyecto busca sentar las bases, por primera vez en el país, de una plataforma molecular que permita utilizar células iPSC (células madre pluripotenciales inducidas) genéticamente modificadas en terapia génica autóloga en pacientes afectados con Retinosis Pigmentaria (RP). La retinosis pigmentaria es un trastorno genético que causa la pérdida de la visión. Particularmente, este proyecto se enfocará en la corrección de la mutación de Parán (deleción de 11pb en el gen RPGR, c.578_588 delCCTGGATCTCT) en líneas iPSC derivadas a partir de pacientes afectados que pertenezcan al mencionado caso multifamiliar.

Con este fin, se busca estandarizar protocolos para la desdiferenciación de fibroblastos de piel para su conversión en células iPSC. Este tipo de células madre es capaz de diferenciarse en cualquier tipo de célula y dividirse indefinidamente. Estas propiedades hacen de las iPSC una fuente confiable y renovable de células indiferenciadas para su uso en terapias de reemplazo autólogo en enfermedades, donde determinados tipos celulares son destruidos, como es el caso de RP. Así mismo, se estandarizarán protocolos de diferenciación de células iPSC para la obtención de células y organoides (cultivos celulares tridimensionales) retinales. De la misma manera, se busca estandarizar protocolos de edición génica en células iPSC utilizando la revolucionaria técnica CRISPR/Cas9, que permite la edición precisa del genoma y es fácilmente programable.

Finalmente, se planea usar los protocolos estandarizados de manera secuencial para obtener células iPSC de pacientes afectados, corregir la mutación de Parán y rediferenciarlas en células y organoides retinales. Una vez caracterizadas las líneas iPSC editadas, estas serán crio-preservadas para su posterior uso. Así, este proyecto sienta las bases para la posterior caracterización de las células y organoides en sistemas in vivo (modelos murinos) y después, en una la tercera fase del estudio, en ensayos clínicos.

Objetivo específico 1

Evaluar clínica y genéticamente a voluntarios (sanos y afectados) de la comunidad de Parán (Huara, Lima) para la correspondiente toma de muestra de fibroblastos

Objetivo específico 2

Estandarizar protocolos para i) la desdiferenciación de fibroblastos usando el método de episomas de Yamanaka, ii) cultivo de células iPSC, iii) diferenciación de iPSC a células foto-receptoras, y iv) edición génica usando la técnica CRISPR/Cas9 en células madre

Objetivo específico 3

Establecer líneas celulares iPSC de 2 pacientes, como mínimo, portadores de la mutación de Parán (c.578_588delCCTGGATCTCT) para su corrección in vitro y criopreservación

Objetivo específico 4

Fortalecer las capacidades locales mediante la formación de recursos humanos y equipamiento y transferir estas tecnologías a las futuras entidades colaboradoras para su desarrollo in vivo.

Institución responsable del proyecto

Universidad de San Martín de Porres

RUC: 20138149022

Tipo de entidad: Universidades que se encuentren licenciadas o en proceso de licenciamiento por la SUNEDU

Régimen: Privado

Tipo de organización: Sin fines de lucro

Departamento: Lima

Provincia: Lima

Distrito: La Molina

Dependencias: Centro de Investigación de Genética y Biología Molecular, Centro de Investigación en Infectología e Inmunología

Institución asociada

Universidad Católica de Santa María

RUC: 20141637941

Tipo de entidad: Universidades que se encuentren licenciadas o en proceso de licenciamiento por la SUNEDU

Régimen: Privado

País: Perú

Departamento: Arequipa

Provincia: Arequipa

Distrito: Arequipa

Institución asociada

University College London

RUC: –

Tipo de entidad: Universidades extranjeras

Régimen: Privado

País: Reino Unido

Departamento: –

Provincia: –

Distrito: –

Institución asociada

MedicVision S.A.C.

RUC: 20131257750

Tipo de entidad: Universidades que se encuentren licenciadas o en proceso de licenciamiento por la SUNEDU

Régimen: Privado

País: Perú

Departamento: Lima

Provincia: Lima

Distrito: Lima

Investigador principal

Nombres: Claudio Nicolás

Apellido paterno: Villegas

Apellido materno: Llerena

Grado académico: Magister

Nombre del grado académico –

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Dependencia: Centro de Investigación de Genética y Biología Molecular

Coinvestigadores

Nombres: Solange Rosa

Apellido paterno: Paredes

Apellido materno: Moscosso

Grado académico: Doctorado

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Dependencia: Centro de Investigación de Genética y Biología Molecular

Coinvestigadores

Nombres: María Luisa

Apellido paterno: Guevara

Apellido materno: Gil

Grado académico: Doctorado

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Dependencia: Centro de Investigación de Genética y Biología Molecular

Coinvestigadores

Nombres: Óscar

Apellido paterno: Acosta

Apellido materno: Conchucos

Grado académico: Magister

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Dependencia: Centro de Investigación de Genética y Biología Molecular

Coinvestigadores

Nombres: José Luis

Apellido paterno: Buleje

Apellido materno: Sono

Grado académico: Doctorado

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Dependencia: Centro de Investigación de Genética y Biología Molecular

Coinvestigadores

Nombres: Joel

Apellido paterno: De León

Apellido materno: Delgado

Grado académico: Doctorado

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Dependencia: Centro de Investigación en Infectología e Inmunología

Coinvestigadores

Nombres: Ricardo Miguel

Apellido paterno: Fujita

Apellido materno: Alarcón

Grado académico: Doctorado

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Dependencia: Centro de Investigación de Genética y Biología Molecular

Coinvestigadores

Nombres: Berly Edinsson

Apellido paterno: Cárdenas

Apellido materno: Pillco

Grado académico: Magister

Entidad: Universidad Católica de Santa María

Dependencia: Facultad de Ciencias e Ingenierías Biológicas y Químicas

Coinvestigadores

Nombres: Selina

Apellido paterno: Wray

Apellido materno: –

Grado académico: Doctor

Entidad: University College London

Dependencia: UCL Queen Square Institute of Neurology

Coinvestigadores

Nombres: Charles

Apellido paterno: Arber

Apellido materno: –

Grado académico: Doctor

Entidad: University College London

Dependencia: UCL Queen Square Institute of Neurology

Coinvestigadores

Nombres: Felix Antonio

Apellido paterno: Torres

Apellido materno: Cotrina

Grado académico: Magister

Entidad: MedicVision SAC

Dependencia: MedicVision SAC

Tesista

Nombres: Tesista no identificado 1

Apellido paterno: –

Apellido materno: –

Tipo de tesis: Maestría

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Tesista

Nombres: Tesista no identificado 2

Apellido paterno: –

Apellido materno: –

Tipo de tesis: Maestría

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Gestor tecnológico

Nombres: Gestor tecnológico no identificado 2

Apellido paterno: –

Apellido materno: –

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Coordinador administrativo

Nombres: Milagro

Apellido paterno Castro

Apellido materno Castro

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Técnico

Nombres: Daisy Maria

Apellidos Obispo Achallma

Entidad: Universidad de San Martín de Porres

Rubros financiables

• Recursos humanos (hasta 50% del monto financiado)

1. Incentivo monetario para el investigador principal y coinvestigadores: no debe sobrepasar el máximo de S/ 2,000 mensuales por investigador.
2. Pago a los tesistas: no debe sobrepasar el máximo de S/ 1,500 mensuales por tesista.
3. Pago al personal técnico o asistente de investigación: no debe sobrepasar el máximo de S/ 1,000 mensuales por técnico.
4. Honorarios o incentivos para un gestor tecnológico: no debe de sobrepasar el máximo de S/. 1,500 mensuales.

• Equipos y bienes duraderos (hasta 20% del monto financiado)

Corresponde a la adquisición de equipos menores para el proyecto de investigación.

• Materiales e insumos

1. Materiales, insumos, reactivos, accesorios, componentes electrónicos o mecánicos, bienes no inventariables.
2. Material bibliográfico, tales como manuales, bases de datos, libros especializados, otros, y/o suscripciones a redes de información (en físico o electrónico).
3. Software especializado para el desarrollo de los proyectos de investigación.

• Viajes

Corresponde a los gastos de viajes relacionados a actividades propias del proyecto de investigación.

Los gastos que aplican para este rubro son los siguientes:

1. Pasajes: terrestres, aéreos, nacionales e internacionales, en clase económica.
2. Viáticos: comprenden los gastos por concepto de alimentación, hospedaje y movilidad (hacia y desde el lugar de embarque), así como el desplazamiento en el lugar donde se realizan las actividades. El concepto de viáticos es aplicable para estancias cuya duración sea menor a los quince (15) días calendario, considerando los topes máximos diarios detallados en el Anexo 2.
3. Manutención: comprenden los gastos de alojamiento, alimentación y movilidad local durante su permanencia en el lugar sede del objeto del beneficio otorgado, o desplazamientos relacionados con el mismo. El concepto de manutención es aplicable siempre que se trate de una estancia cuya duración sea mayor o igual a quince (15) días calendario, considerando los topes máximos diarios detallados en la convocatoria.
4. Seguro de viaje: el seguro es de carácter obligatorio y su valor debe estar de acuerdo al precio de mercado. La cobertura típicamente incluye gastos médicos de emergencia, muerte accidental, invalidez e imprevistos logísticos durante el viaje (retraso de vuelos, demora o pérdida de equipaje, robos, etc.). El precio del seguro puede variar en función a la edad, duración del viaje y el destino. Se puede financiar hasta un máximo de S/ 2,000.

• Servicios de no consultoría.

Corresponde a los gastos de contratación de personas naturales o jurídicas para la ejecución de actividades de índole técnica especializada, consideradas como críticas para lograr el buen resultado del proyecto de investigación: servicios de laboratorio, colección de datos, procesamiento de muestras, análisis y diseño.

• Otros servicios

Corresponde a los gastos de contratación de personas naturales o jurídicas para la ejecución de actividades complementarias del proyecto de investigación, tales como:

1. Actividades de difusión:

1. Gastos de organización de taller de cierre del proyecto.
2. Costo de publicación de artículos en revistas indizadas.

• Costo de inscripción para participar en eventos o para discutir los resultados con personal interesado o calificado.

1. Actividades complementarias de la investigación:

1. Gastos de importación y desaduanaje de materiales, insumos o equipos relacionados al proyecto de investigación que se adquieran en el extranjero.
2. Gastos relacionados a la obtención del título o grado.

• Gastos relacionados a la solicitud de patentes.

1. Gastos de mantenimiento correctivo para los equipos adquiridos u otro equipo de laboratorio que deba usarse en el proyecto.

• Gastos de gestión (hasta 10% del monto financiado)

Corresponde al incentivo monetario para el coordinador administrativo, útiles de oficina y servicios de imprenta.