La Leishmaniasis Tegumentaria Americana provoca morbilidad significativa y pérdidas económicas en Perú y Latinoamérica. Está presente en 19 departamentos del Perú con aproximadamente 6000 casos anuales de Leishmaniasis Cutánea (LC) y 350 casos de Leishmaniasis Mucosa (LM). El Perú es uno de los 10 países que en conjunto representan el 90 % de casos de LC en el mundo. Los tratamientos con antimoniales pentavalentes o amfotericina son tóxicos y significan una carga económica al sistema nacional de salud. El diagnóstico temprano de casos, seguido de un tratamiento adecuado, es esencial para el control de la enfermedad. Sin embargo, las pruebas de diagnóstico disponibles son invasivas e imprecisas y requieren experiencia técnica (demostración parasitológica del parásito en frotis de tejidos) o equipos sofisticados, personal capacitado y costos elevados (pruebas moleculares para la detección de kDNA del parásito). Por otro lado, las pruebas serológicas convencionales son asequibles, pero presentan reacciones inespecíficas que pueden resultar en falsos positivos. El Ensayo de Flujo Laminar (LFA por sus siglas en inglés) es el único formato de diagnóstico rápido que cumple con los criterios ASSURED (siglas en inglés: Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Rapid, Equipment free, and Deliverable) de la OMS. Su aplicación es vasta y de bajo costo, por lo que presenta una alternativa para el diagnóstico rápido y barato. De este modo, el objetivo de la propuesta es desarrollar un método LFA listo para ser traducido a un prototipo que permita el diagnóstico efectivo de pacientes con úlceras que acuden a centros de atención primaria de salud. Dos oligopéptidos, opH2A y opLiP2a, específicos de leishmania (patente WIPO/PCT:WO2015001383) ,que han sido ya validados en formato de ELISA para el serodiagnóstico de LC se transferirán a un formato LFA y, posteriormente, se validará su precisión diagnóstica, todo ello mediante investigación colaborativa con investigadores de áreas endémicas del país.

La leishmaniasis es una enfermedad infecciosa con un promedio de 6000 casos reportados de LC por año en el Perú. Se considera que esta cifra es un subestimado, a pesar de ser leishmaniasis una enfermedad de reporte obligatorio. El Perú se encuentra dentro de los nueve países con mayor carga negativa en años de vida ajustados en función de la discapacidad (DALY por sus siglas en inglés). A pesar de ser un problema de salud pública, en el Perú y otros países existe muy poco interés por las empresas o instituciones que desarrollan pruebas de diagnóstico. Causa de ello es el poco atractivo económico y las condiciones adversas en las que los métodos de diagnóstico tendrían que llevarse a cabo. La mayor proporción de pacientes se dedica a diversas actividades extractivas o de agricultura de subsistencia en áreas endémicas donde se da la transmisión zoonótica, lo que explica sus muy escasos ingresos económicos. De otro lado, la gran dispersión geográfica explica que se encuentren alejados de centros de salud en áreas urbanas con la consiguiente limitación a pruebas que podrían considerarse sofisticadas para el contexto donde se da la enfermedad. No es posible extrapolar la realidad del diagnóstico de enfermedades de carácter urbano mediante sistemas sociales de acceso masivo a la salud, con aquellos de carácter rural y ajenos a la cobertura centralizada que pueda dar el ministerio de salud. La leishmaniasis demanda un diagnóstico descentralizado y de amplia cobertura geográfica.

A pesar de los avances científicos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, el diagnóstico de leishmaniasis se realiza mediante una asociación de datos clínicos, epidemiológicos y pruebas convencionales de laboratorio, las que presentan baja sensibilidad (diagnósticos parasitológicos directos) o pobre especificidad (diagnósticos serológicos indirectos). Existen, sin embargo, otros métodos más sofisticados, como la detección del ADN del parásito, el cual da una mayor sensibilidad y especificidad, pero involucra mayor costo, infraestructura, insumos y personal capacitado. De ahí que solo pueda ser realizado por los institutos de referencia y/o centros de investigación y/o hospitales de referencia.

En el caso de leishmaniasis del Viejo Mundo, donde la Leishmaniasis Visceral es un problema de salud pública por ser mortal, se ha desarrollado un sistema de inmunocromatografía en formato Lateral Flow Assay (LFA) con proteínas recombinantes (Anfossi et al 2018). También se ha desarrollado una prueba similar, pero con antígenos crudos fijados (Schallig et al. 2004). En el caso de Leishmaniasis Cutánea (LC), existe un test LFA (CL Detect fabricado por InBios), pero para detectar antígenos de L. major en úlceras del Viejo Mundo. Los autores de esa prueba señalan que su uso es limitado a esa especie. En el caso de leishmaniasis cutánea americana, donde las úlceras de piel son prevalentes, no existen pruebas en formato LFA. Más aún, para todas las leishmaniases, tanto del Nuevo como del Viejo Mundo, no existen pruebas de LFA basadas en oligopéptidos fijados en un dispositivo LFA. Esta estrategia, basada en síntesis química de oligopéptidos como alternativa al empleo de antígenos a proteínas nativas o recombinantes, ofrece la ventaja de tener una fuente continua de reactivos de elevadísima pureza, sin opciones de artefactos por contaminantes por el proceso de purificación de proteínas; de obviar los problemas de bioseguridad inherentes a los procesos de producción biológica; y, finalmente, por el costo bajísimo de producción.

La leishmaniasis tegumentaria americana es una enfermedad parasitaria desatendida, relacionada a la pobreza y constituye un serio problema de salud pública a nivel regional en América Latina. Es causa de significativa morbilidad y pérdidas económicas en las regiones endémicas. La leishmaniasis cutánea es la forma clínica más prevalente en el Perú, con un promedio estimado de 6000 casos por año durante el periodo 2004 – 2017. La zona endémica abarca el 76 % del territorio nacional y está comprendida por las franjas andina y selvática del país, con una población en riesgo de infección de más de 1 millón de habitantes. Esta se encuentra compuesta, principalmente, por agricultores o personas dedicadas a la extracción de recursos naturales. La mejora del diagnóstico y vigilancia epidemiológica de leishmaniasis en el país y la región de América Latina es una prioridad de investigación. Actualmente, no se cuentan con pruebas diagnósticas accesibles y asequibles para establecimientos de Atención Primaria de Salud (POC por sus siglas en inglés, Point of Care). Si bien las pruebas convencionales logran demostración parasitológica del parásito en frotis de tejidos; sin embargo, presentan sensibilidades bajas y requieren de personal capacitado. Por otro lado, las pruebas moleculares para la detección del kDNA del parásito, si bien son altamente sensibles y específicos, están confinadas a laboratorios centrales de referencia debido al requerimiento de una infraestructura especializada, experiencia técnica del personal y alto costo.

En años recientes, las pruebas serológicas han cobrado atención debido a su potencial de ser desarrolladas para uso en POC. El diagnóstico serológico tradicional, en formato de ELISA o Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) con antígenos Crudos, está limitado por baja sensibilidad y reactividad cruzada (ej. con la enfermedad de Chagas). Nuestro grupo de investigación ha demostrado y patentado a nivel internacional dos oligopéptidos opH2A y opLiP2a (WIPO/PCT:WO2015001383). Ellos han sido estandarizados y validados en un formato de ELISA indirecto alcanzando un rendimiento diagnóstico con 92 % de valor predictivo positivo y 86 % como valor predictivo negativo. Esos valores, más las características de estabilidad y adecuación a centros descentralizados y equipados de salud, lo convierten en la mejor alternativa para adaptarlos a una prueba rápida de diagnóstico. Una prueba de diagnóstico rápido, aplicable a POC, se caracteriza por tener resultados en menos de una hora, lo que permite tomar decisiones adecuadas de tratamiento y, con ello, mejoras en la eficiencia del sector salud. El Ensayo de Flujo Laminar (LFA por sus siglas en inglés) es el único formato de diagnóstico rápido que cumple con los criterios ASSURED de la OMS: se basa en el principio de inmunocromatografía, es fácil de usar, requiere de equipamiento mínimo, es barato y aplicable a centros de atención primaria rural en áreas endémicas del país. Todos esos atributos explican su uso cada vez mayor a nivel mundial, proyectándose un valor económico notable con un mercado estimado en casi 8,000 millones para el 2022.

En el caso de leishmaniasis cutánea (uta), donde las úlceras de piel son prevalentes, no existen pruebas en formato LFA. Los oligopéptidos patentados arriba descritos pueden ser adaptados a un sistema de LFA para poder aplicarse en áreas rurales endémicas donde la vasta mayoría de casos de LC se concentran. Los productos de esta propuesta permitirán el diagnóstico temprano y, como consecuencia, el inicio de un tratamiento oportuno, hecho esencial para el control de la enfermedad. Además, dada la distribución de las especies de leishmania en Sur, Centro y Norte América se espera que la innovación tecnológica aquí planteada pueda ser aplicada a otros países y sea comercializada a través de licenciamiento de patente.

Modalidad de proyecto: Proyecto de investigación avanzado

Los proyectos deben ser presentados de manera asociativa (con una o más entidades asociadas).

La conformación mínima es la siguiente:

• Un investigador principal
• Un coinvestigador
• Un tesista de posgrado
• Un gestor tecnológico
• Un coordinador administrativo

Tipo de proyecto: Investigación aplicada

Subsector: Salud

Sector: General

Lugar de ejecución del proyecto: Lima, Cusco, Huánuco

Fecha de inicio:  10/12/2018

Fecha de cierre:  10/12/2021

Plazo de ejecución (meses): 36

Objetivo principal

Desarrollar un método de diagnóstico rápido de leishmaniasis ccutánea, capaz de implementarse en centros de atención primaria de salud en áreas rurales endémicas del país. El tiempo de emisión de resultado de laboratorio será antes de las 24 horas, lo cual aliviará la pérdida de jornadas laborables. Los pacientes afectados trabajan en su mayoría dispersos en medios rurales y a distancias que hacen necesario el diagnóstico in situ. De otro lado, centros de atención primaria podrán satisfacer la demanda de obtener el resultado de laboratorio de manera simple y que el análisis no demande entrenamiento y reforzamiento periódico del personal técnico.

Construiremos, para ello, un dispositivo de Lateral Flow Assays (LFA), que es la tecnología de inmunocromatografía predominante a nivel global por su sencillez, reproducibilidad y estabilidad a las condiciones de medio ambiente más diversas. Optimizaremos la unión irreversible de los antígenos opH2A y opLiP2a, los que serán la diana de los anticuerpos del paciente. Éstos oligopéptidos han sido ya validados como herramienta de diagnóstico por ELISA. El desempeño del sistema LFA será comparado contra ELISA y contra un sistema equivalente, pero basado en antígenos crudos de leishmania. Evaluaremos el desempeño del LFA desarrollado en manos de investigadores de la UNSAAC, y utilizando las muestras de pacientes de la ciudad del Cusco que acuden a la UNSAAC referidos por sus médicos tratantes.

Transferiremos y evaluaremos el empleo de los dispositivos LFA a centros de atención primaria pobremente equipadas en áreas endémicas de leishmaniasis del Cusco y de Huánuco. Se obtendrá los valores de sensibilidad y especificidad diagnósticas y los valores predictivos positivos y negativos. En resumen, desarrollaremos un prototipo LFA que será una prueba rápida y óptima de diagnóstico, cuyo uso sea amigable para personal de salud con formación básica que trabaja en centros de atención primaria de salud con equipamientos escasos.

Objetivo específico 1

Determinación y estandarización de las condiciones adecuadas para la elaboración de prototipo de diagnóstico rápido en formato LFA para diagnóstico de leishmaniasis.

Para asegurar el correcto funcionamiento de una prueba diagnóstica, esta debe ser estandarizada y optimizada de manera que el ensayo sea capaz de identificar la presencia o ausencia de la enfermedad, incluso en pacientes con títulos muy bajos de anticuerpos. De otro lado, el lograr éste objetivo representa un salto cualitativo importante, pues demostrará que ciertos oligopéptidos de capacidad diagnóstica comprobada están fijos de manera irreversible para su uso diagnóstico por LFA.

Se realizará la transferencia de los oligopéptidos y los antígenos crudos a una matriz sólida escogida según las características de las moléculas a fijar. También se determinará el conjugado a utilizar oro coloidal en primera instancia, pero con opciones a otras moléculas que confieren una mayor sensibilidad. Se buscará el balance entre el costo y el beneficio. Finalmente, se escogerán las mejores condiciones de almacenamiento y transporte y su tolerancia a temperaturas y humedades diversas para su adecuación a los centros de atención primaria de áreas endémicas de leishmaniasis (ver objetivos específico 2 y 3).

Objetivo específico 2

Validación de las pruebas LFA en centros de investigación en la región Cusco. Un aspecto importante de la propuesta es transferir la herramienta de diagnóstico LFA al laboratorio de la UNSAAC, pues sus investigadores están cercanos físicamente a las áreas endémicas de su región amazónica. Ellos, además, son los responsables de incrementar el conocimiento epidemiológico de una enfermedad que es particularmente importante para la región Cusco.

Este objetivo transferirá las herramientas desarrolladas en el objetivo 1 a los investigadores que seguirán de cerca a los profesionales del sector salud que evaluarán la efectividad diagnóstica en centros médicos rurales. Para ello se requiere, primero, reproducir el desempeño obtenido en la UPCH (lo que comprobaría que se ha desarrollado un LFA robusto y reproducible); y, segundo, transferir la capacidad de enseñar la metodología LFA a los profesionales de áreas rurales para que estén debidamente preparados para lograr el objetivo 3. También con ello estarán preparados para realizar el monitoreo del uso del LFA en campo. Este objetivo requiere una colaboración horizontal y estrecha entre las entidades solicitante y asociada. En esta dinámica el rol del estudiante de maestría jugará un rol pivotal para el logro de la transferencia tecnológica.

Objetivo específico 3

Evaluación del prototipo diagnóstico LFA en centros de atención primaria de salud en la región de Cusco y Huánuco para la determinación de la capacidad diagnóstica en base a sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos y valores predictivos negativos.

Los parámetros de desempeño de la prueba diagnóstica, sea en su laboratorio de origen (entidad solicitante) o sea en la transferencia a un laboratorio equipado de una región altamente endémica para leishmaniasis (entidad asociada), no son necesariamente los mismos que se pueden alcanzar en POC rurales. Desde las condiciones climatológicas, de almacenamiento, de capacidad de aprendizaje del personal del POC que atiende otras demandas de salud en ese establecimiento, y otras más condiciones, afectarán la efectividad diagnóstica, es decir, el desempeño del test en condiciones reales, las que se alejan de las condiciones controladas en un laboratorio experimental de investigación.

Este objetivo es la culminación de etapas previas. Aquí se pondrá a prueba el desempeño del LFA desarrollado por la entidad solicitante y transferido a la entidad asociada para la capacitación de personal de centros de salud de Cusco y Huánuco (ver Ayuda Memoria Ambiente), incluyendo postas médicas de centros rurales de atención primaria de salud. Este objetivo requiere un aprendizaje mínimo del procedimiento y una gran rigurosidad objetiva por parte de las personas responsables del ensayo del LFA. Para obtener la Precisión Diagnóstica (Diagnostic Accuracy) se comparará contra el sistema de oligopéptidos ELISA y contra un panel de diagnósticos moleculares incluida la PCR.

Institución responsable del proyecto

Universidad Peruana Cayetano Heredia

RUC: 20110768151

Tipo de entidad: Universidades que se encuentren licenciadas o en proceso de licenciamiento por la SUNEDU

Régimen: Privado

Tipo de organización: Sin fines de lucro

Departamento: Lima

Provincia: Lima

Distrito: San Martin de Porres

Dependencias: Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID) – Facultad de Ciencias y Filosofía

Institución asociada

Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco

RUC: 20172474501

Tipo de entidad: Universidades que se encuentren licenciadas o en proceso de licenciamiento por la SUNEDU

Régimen: Público

País: Perú

Departamento: Cusco

Provincia: Cusco

Distrito: Cusco

Investigador principal

Nombres: Jorge Luis

Apellido paterno: Arévalo

Apellido materno: Zelada

Grado académico: Doctorado

Nombre del grado académico: Licenciado en Biología

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Dependencia: Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID) – Facultad de Ciencias y Filosofía

Coinvestigador

Nombres: María Fabiola

Apellido paterno: Valdivia

Apellido materno: Francia

Grado académico: Magister

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Dependencia: Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID) – Facultad de Ciencias y Filosofía

Coinvestigador

Nombres: Allison Melanie

Apellido paterno: Aroni

Apellido materno: Soto

Grado académico: Magister

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Dependencia: Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID) – Facultad de Ciencias y Filosofía

Coinvestigador

Nombres: María Antonieta

Apellido paterno: Quispe

Apellido materno: Ricalde

Grado académico: Doctorado

Entidad: Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco

Dependencia: Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias

Tesista

Nombres: Tesista no identificado 1

Apellido paterno: –

Apellido materno: –

Tipo de tesis: Maestría

Entidad: Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco

Gestor tecnológico

Nombres: Sergio Luis

Apellido paterno: Vilca

Apellido materno: Flores

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Coordinador administrativo

Nombres: Miryan Elizabet

Apellido paterno: Malca

Apellido materno: Palacios

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Técnico

Nombres: Técnico no identificado 1

Apellidos: –

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Apellido paterno: Aroni

Apellido materno: Soto

Grado académico: Magister

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Dependencia: Laboratorios de Investigación y Desarrollo (LID) – Facultad de Ciencias y Filosofía

Coinvestigador

Nombres: María Antonieta

Apellido paterno: Quispe

Apellido materno: Ricalde

Grado académico: Doctorado

Entidad: Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco

Dependencia: Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias

Tesista

Nombres: Tesista no identificado 1

Apellido paterno: –

Apellido materno: –

Tipo de tesis: Maestría

Entidad: Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco

Gestor tecnológico

Nombres: Sergio Luis

Apellido paterno: Vilca

Apellido materno: Flores

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Coordinador administrativo

Nombres: Miryan Elizabet

Apellido paterno: Malca

Apellido materno: Palacios

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Técnico

Nombres: Técnico no identificado 1

Apellidos: –

Entidad: Universidad Peruana Cayetano Heredia

Rubros financiables

• Recursos humanos (hasta 50% del monto financiado)

1. Incentivo monetario para el investigador principal y coinvestigadores: no debe sobrepasar el máximo de S/ 2,000 mensuales por investigador.
2. Pago a los tesistas: no debe sobrepasar el máximo de S/ 1,500 mensuales por tesista.
3. Pago al personal técnico o asistente de investigación: no debe sobrepasar el máximo de S/ 1,000 mensuales por técnico.
4. Honorarios o incentivos para un gestor tecnológico: no debe de sobrepasar el máximo de S/. 1,500 mensuales.

• Equipos y bienes duraderos (hasta 20% del monto financiado)

Corresponde a la adquisición de equipos menores para el proyecto de investigación.

• Materiales e insumos

1. Materiales, insumos, reactivos, accesorios, componentes electrónicos o mecánicos, bienes no inventariables.
2. Material bibliográfico, tales como manuales, bases de datos, libros especializados, otros, y/o suscripciones a redes de información (en físico o electrónico).
3. Software especializado para el desarrollo de los proyectos de investigación.

• Viajes

Corresponde a los gastos de viajes relacionados a actividades propias del proyecto de investigación.

Los gastos que aplican para este rubro son los siguientes:

1. Pasajes: terrestres, aéreos, nacionales e internacionales, en clase económica.
2. Viáticos: comprenden los gastos por concepto de alimentación, hospedaje y movilidad (hacia y desde el lugar de embarque), así como el desplazamiento en el lugar donde se realizan las actividades. El concepto de viáticos es aplicable para estancias cuya duración sea menor a los quince (15) días calendario, considerando los topes máximos diarios detallados en el Anexo 2.
3. Manutención: comprenden los gastos de alojamiento, alimentación y movilidad local durante su permanencia en el lugar sede del objeto del beneficio otorgado, o desplazamientos relacionados con el mismo. El concepto de manutención es aplicable siempre que se trate de una estancia cuya duración sea mayor o igual a quince (15) días calendario, considerando los topes máximos diarios detallados en la convocatoria.
4. Seguro de viaje: el seguro es de carácter obligatorio y su valor debe estar de acuerdo al precio de mercado. La cobertura típicamente incluye gastos médicos de emergencia, muerte accidental, invalidez e imprevistos logísticos durante el viaje (retraso de vuelos, demora o pérdida de equipaje, robos, etc.). El precio del seguro puede variar en función a la edad, duración del viaje y el destino. Se puede financiar hasta un máximo de S/ 2,000.

• Servicios de no consultoría.

Corresponde a los gastos de contratación de personas naturales o jurídicas para la ejecución de actividades de índole técnica especializada, consideradas como críticas para lograr el buen resultado del proyecto de investigación: servicios de laboratorio, colección de datos, procesamiento de muestras, análisis y diseño.

• Otros servicios

Corresponde a los gastos de contratación de personas naturales o jurídicas para la ejecución de actividades complementarias del proyecto de investigación, tales como:

1. Actividades de difusión:

1. Gastos de organización de taller de cierre del proyecto.
2. Costo de publicación de artículos en revistas indizadas.

• Costo de inscripción para participar en eventos o para discutir los resultados con personal interesado o calificado.

1. Actividades complementarias de la investigación:

1. Gastos de importación y desaduanaje de materiales, insumos o equipos relacionados al proyecto de investigación que se adquieran en el extranjero.
2. Gastos relacionados a la obtención del título o grado.

• Gastos relacionados a la solicitud de patentes.

1. Gastos de mantenimiento correctivo para los equipos adquiridos u otro equipo de laboratorio que deba usarse en el proyecto.

• Gastos de gestión (hasta 10% del monto financiado)

Corresponde al incentivo monetario para el coordinador administrativo, útiles de oficina y servicios de imprenta.